رنگ آمیزی باکتری ها

مقدمه

در عمل باکتریهایی که دارای خواص یکسانی باشند بندرت یافت می‌شوند، حتی باکتریهایی که از یک سلول منشا می‌گیرند ممکن است از نظر یک یا چند صفت با یکدیگر متفاوت باشند. این تفاوتها نتیجه تغییراتی است که به علت جهش ژنی یا موتاسیون در سلولهای باکتریایی پدید می‌آید. این باکتریهای تغییر یافته ، موتانت Mutant نامیده می‌شوند که از نظر بعضی از خواص نظیر ساختمان آنتی ‌ژن ، حساسیت در مقابل آنتی بیوتیکها و ... با سایر باکتریهای مشابه اختلاف دارند.

سهولت تغییرپذیری در باکتریها مربوط به سرعت تقسیم آنهاست. زمان تقسیم یا مدت زمانی که برای تولید یک سلول جدید در باکتریها لازم است، حدود 2 دقیقه و در مورد انسان 20 سال است. مثلا یک سلول باکتری در مدت 18 ساعت 54 نسل بوجود می‌آورد. درحالیکه برای ایجاد همین تعداد نسل انسان بیش از 1000 سال زمان لازم است. پس جهش ژنی در باکتریها نسبت به موجودات عالی خیلی سریع و قابل ملاحظه است.

رنگ آمیزی گرم :THE GRAM STAIN

این روش رنگ آمیزی یکی از مهمترین ومتداولترین روشهای رنگ آمیزی درباکتری شناسی است که اولین بار توسط کریسین گرم ابداع شد . دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت وگرم منفی تقسیم می شوند . رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتیبه ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . دررنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می شود

مکانیسم :

رنگ کریستال ویوله رابه مدت 30تا45 ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها بهرنگ بنفش درخواهد درآمد

پس از شستشو گسترش با آب به مدت 30تا45 ثانیه بالوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند .

مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت 15 تا20 ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد  . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .

4- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت 30 تا45 ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .

Gram stain of Staphylococcus aureus

Gram stain of Escherichia coli

رنگ آمیزی گرم:

رنگ آمیزی گرم(gram staining) یکی از مهمترین و متداولترین روش های رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است که اولین بار توسط"کریستین گرم" ابداع شد.در این رنگ آمیزی باکتری ها بر مبنای رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به 2دسته "گرم مثبت و منفی" تقسیم می شوند.رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول و به عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد.

در رنگ آميزي گرم باكتري هاي گرم مثبت پس از رنگ آميزي به رنگ بنفش و باكتري هاي گرم منفي به رنگ قرمز مشاهده مي شود.گرچه هردو گروه يعني باكتري هاي گرم مثبت و منفي داراي ديواره مي باشند ولي فرق بين اين دو گروه مربوط به خواصي است كه در ساختمان ديواره سلولي آنها وجود دارد.اساس ساختمان در ديواره سلولي باكتري هاي گرم مثبت يك لايه ضخيمي است از پپتيدوگليكان ولي در باكتري هاي گرم منفي ضخامت آن به حداقل مي رسد.

كاربرد رنگ آميزي گرم:

از رنگ آميزي گرم به دوجهت استفاده مي شود:

™   شناسايي جنس باكتري

™ انتخاب آنتي بيوتيك مناسب (باكتري هاي گرم مثبت در مقايسه با باكتري هاي گرم منفي نسبت به پني سيلين Gحساسيت بيشتري دارند.)

à   با اين حال همه ي باكتري ها را نميتوان با رنگ آميزي گرم مشاهده كرد.

روش رنگ آميزي باكتري هاي گرم مثبت و منفي:

1-ريختن يك قطره آب مقطر روي لام

2-برداشتن يك لوپ از باكتري و مخلوط كردن با آب مقطر

3-خشك كردن نمونه در مجاورت هوا و فيكسه كردن آن

4-افزدن رنگ اوليه (در اين مرحله رنگ كريستال ويوله به مدت 1 دقيقه اضافه مي شود.)

5-شستشو با آب و خشك كردن در معرض هوا

6- افزودن محلول لوگول که یک محلول تثبیت کننده است به مدت 1 دقیقه

7- شستشو با آب و خشك كردن در معرض هوا

8- افزودن محلول رنگ بر ( الکل ) به مدت 20 دقيقه

™  این عامل دو عمل را انجام می دهد:

الف)حلال چربی است.                 

 ب) دهیدراته کننده پروتئین ها است.

9- شستشو با آب و خشك كردن در معرض هوا

10- اضافه کردن رنگ سافرانین به مدت 10 ثانیه (که در باکتری گرم مثبت به دلیل ضخامت بیشتر دیواره رنگ باقی مانده از سافرانین را در خود نگه میدارد در صورتیکه در باکتری گرم منفی بعد از رنگبری با الکل ضخامتی از دیواره باقی نمانده یا بسیار کم است و رنگ را در خود نگه نمی دارد.)

11- شستشو با آب و خشك كردن در معرض هوا

çبا مشاهده ی باکتری در زیر میکروسکوپ با عدسی 60 تفاوت رنگ باقی مانده در هر2 نمونه را می بینیم، که باکتری گرم مثبت به رنگ بنفش و باکتری گرم منفی به رنگ قرمز یا صورتی دیده می شود.